近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術快速發(fā)展，其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。想完成這一系列檢測分析肯定離不開一間功能完備的實驗室，那么，關于二代測序?qū)嶒炇已b修都應注意什么？
實驗室總體要求
NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南（試行）》、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》、《個體化醫(yī)學檢測質(zhì)量保證指南》、《腫瘤個體化治療檢測技術指南》、《個體化醫(yī)學檢測實驗室管理辦法》、《測序技術的個體化醫(yī)學檢測應用技術指南（試行）》進行。
1、NGS檢測人員的資質(zhì)要求：NGS檢測技術人員應具備臨床病理學、分子生物學的相關專業(yè)大專以上學歷，并經(jīng)過NGS技術的理論與技能培訓合格。數(shù)據(jù)分析人員應具有臨床醫(yī)學或分子生物學或遺傳學知識背景并經(jīng)生物信息學培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經(jīng)培訓合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權簽字人(醫(yī)學博士學位或高級職稱)審核。
2、NGS檢測實驗室的區(qū)域設置要求：原則上NGS實驗室應當有以下分區(qū)：樣本前處理區(qū)、試劑儲存和準備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū)/多重PCR區(qū)域（第一擴增區(qū)）、文庫擴增區(qū)（第二擴增區(qū)）、文庫檢測與質(zhì)控區(qū)、測序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》。分區(qū)可根據(jù)實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應與組織樣本分開。
3、NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)認可產(chǎn)品。涉及到實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過臨床實驗室自建項目(LDT)驗證合格才可使用。每個NGS檢測項目在驗證時需要根據(jù)建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數(shù)變異Copynumber variations（CNVs）、染色體結構變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的準確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進行LDT驗證。應該有經(jīng)過標準品測試的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測序深度。經(jīng)驗證后，SOP發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實驗結果簽名留底備案。
4、NGS檢測實驗室的質(zhì)量管理要求：NGS檢測主要包括實驗操作和生物信息
學分析兩部分。實驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標區(qū)域富集、測序等；生物信息學分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實驗室質(zhì)量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內(nèi)質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評以有及持續(xù)的質(zhì)量保證和改進計劃。
NGS分析樣本、基因panel和轉(zhuǎn)運要求
NGS分析樣本類型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。
對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應首選經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎上的再次檢測可選取液體樣本動態(tài)監(jiān)測。
NGS檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因panel測序。
不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機構的專家共同決定，已達到不同實驗室之間的可比性和完善性。
未經(jīng)病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
樣本質(zhì)量對檢測結果和分析至關重要，病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCl脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上，低于此標準可富集后檢測。
NGS檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理SOP指導。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運輸）應有相關運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。
NGS檢測流程中的質(zhì)量標準
1、核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是NGS檢測成功的關鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質(zhì)量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。
2、文庫制備及其質(zhì)量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區(qū)域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質(zhì)量分析。每個檢測項目應設定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標準。
3、NGS測序儀上機分析及其質(zhì)量分析：NGS建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時根據(jù)檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當?shù)男酒员ＷC測序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內(nèi)容、設定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進行測序。產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)要求詳見后文。
4、NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行SNV位點信息的測定，在NGS檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。（2）陽性對照：應用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。（4）應對方案和替代方法：各個質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異常或失敗，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質(zhì)量差或有問題的區(qū)域應建立替代方法（如Sanger測序）。
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